防治奶牛乳腺炎的抗微生物藥
靶動(dòng)物安全性和有效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則

一、概述

（一）目的

為指導(dǎo)申報(bào)單位開展抗微生物藥物防治奶牛乳腺炎的安全性和有效性研究，特制定本指導(dǎo)原則。

（二）適用范圍

適用于通過(guò)乳房灌注給藥防治奶牛乳腺炎的制劑。

（三）術(shù)語(yǔ)

乳腺炎（Mastitis）：通常是由一種或多種病原微生物引起的乳腺炎癥，以乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生病理學(xué)改變?yōu)樘卣?，繼而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和分泌變化，受感染乳區(qū)白細(xì)胞增多。

臨床型乳腺炎（Clinical infectious mastitis）：1個(gè)或多個(gè)乳區(qū)有臨床癥狀（腫脹、發(fā)熱、痛感、潮紅）且乳汁外觀改變（凝乳塊或絮狀物、水樣外觀，顏色變化），并伴有或無(wú)一般臨床癥狀（發(fā)熱、食欲減少）的乳腺炎。

亞臨床型（隱性）乳腺炎（Sub-clinical infectious mastitis）：乳腺炎的一種形式，乳房和乳汁肉眼觀察無(wú)異常，但乳汁理化性質(zhì)發(fā)生變化，乳汁體細(xì)胞數(shù)明顯增加，且細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)存在病原微生物。

體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)（Quantitative somatic cell count，QSCC）：利用庫(kù)氏計(jì)數(shù)器或電子體細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)等測(cè)定乳汁中的體細(xì)胞數(shù)。

二、防治乳腺炎產(chǎn)品的靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)（刺激性試驗(yàn)）

（一）概述

申報(bào)單位必須證明擬上市的用于防治奶牛乳腺炎的產(chǎn)品對(duì)靶動(dòng)物是安全的。下述的安全性試驗(yàn)用于證明受試藥對(duì)靶動(dòng)物的安全性。另外，在療效試驗(yàn)期間，藥物發(fā)生的任何不良反應(yīng)也應(yīng)予以報(bào)告。

（二）受試動(dòng)物

1. 用于泌乳期的獸藥

選擇健康無(wú)乳腺炎的經(jīng)產(chǎn)奶牛和初產(chǎn)奶牛各6頭，每組應(yīng)有半數(shù)奶牛（3頭）的日產(chǎn)奶量在25kg以上（泌乳早期）、半數(shù)奶牛（3頭）的日產(chǎn)奶量在15kg以下（泌乳后期）。

對(duì)每頭受試動(dòng)物應(yīng)說(shuō)明其年齡、泌乳階段、擠奶次數(shù)以及日產(chǎn)奶量情況。

2. 用于干乳期的獸藥

選擇6頭正常經(jīng)產(chǎn)奶牛（已完成2次及2次以上泌乳的經(jīng)產(chǎn)奶牛）和6頭初產(chǎn)奶牛（完成第一個(gè)哺乳期的初產(chǎn)奶牛）。

對(duì)每頭受試動(dòng)物應(yīng)說(shuō)明其年齡、擠奶次數(shù)方面的情況。對(duì)經(jīng)產(chǎn)奶牛要說(shuō)明前一個(gè)泌乳期的產(chǎn)奶量。

（三）受試藥物

擬用于防治奶牛乳腺炎的制劑。

（四）給藥與采樣

1. 給藥前

給藥前至少間隔24小時(shí)連續(xù)2次采集每頭牛的4個(gè)乳區(qū)奶樣，分別進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)，以確定受試動(dòng)物是否健康。

2. 給藥

在第2次采樣后間隔24小時(shí)開始按照標(biāo)明的藥物給藥方案給藥，且每頭牛的4個(gè)乳區(qū)均需給藥。

3. 給藥后采樣

（1）泌乳期產(chǎn)品

對(duì)于多次給藥的產(chǎn)品，自第二次給藥開始，每次給藥前采集每頭牛的四個(gè)乳區(qū)奶樣，進(jìn)行體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。并分別在最后一次給藥結(jié)束后12小時(shí)和第7天采樣進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。

（2）干乳期產(chǎn)品

分別于給藥結(jié)束后12小時(shí)和第7天采集每頭牛的4個(gè)乳區(qū)奶樣，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。

（五）數(shù)據(jù)收集與結(jié)果評(píng)價(jià)

一般性信息：包括動(dòng)物身份的識(shí)別信息、試驗(yàn)地點(diǎn)、試驗(yàn)編號(hào)、觀察日期、測(cè)試天數(shù)和時(shí)間，以及每個(gè)受試牛的產(chǎn)奶量和體溫。

一般臨床觀察：每天2次，對(duì)每頭牛的4個(gè)乳區(qū)進(jìn)行檢查，并進(jìn)行觸診，以表明有無(wú)腫脹、潮紅和疼痛等反應(yīng)；另外，在每個(gè)階段還要通過(guò)定量計(jì)數(shù)方法測(cè)定體細(xì)胞數(shù)。

根據(jù)所收集的上述數(shù)據(jù)及臨床檢查結(jié)果確定防治乳腺炎產(chǎn)品對(duì)靶動(dòng)物的安全性。

三、防治乳腺炎產(chǎn)品的藥物有效性研究

（一）一般性原則

對(duì)治療臨床型乳腺炎的藥物，其用藥條件是：動(dòng)物應(yīng)存在某種入侵乳房的病原菌、有細(xì)胞學(xué)反應(yīng)且牛奶出現(xiàn)異常，或者出現(xiàn)臨床癥狀（如腫脹、潮紅和痛感），或者兩者同時(shí)存在。對(duì)治療亞臨床型乳腺炎的藥物，其用藥條件是：動(dòng)物應(yīng)存在某種入侵乳房的病原菌和有細(xì)胞學(xué)反應(yīng)。

在臨床研究中，乳腺炎致病菌分布情況將用于確定標(biāo)簽的療效說(shuō)明。這需要有足夠數(shù)量的主要乳腺炎致病菌以證明其有效性。

應(yīng)報(bào)告體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)結(jié)果。該信息將用于檢查在各治療組內(nèi)“治愈”和“未治愈”奶牛體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)平均值之間的變化趨勢(shì)。

數(shù)據(jù)收集應(yīng)來(lái)自具有代表性的靶牛群。為此應(yīng)對(duì)靶牛群中所有泌乳或非泌乳奶牛（取決于標(biāo)簽說(shuō)明中擬用的適應(yīng)證）進(jìn)行檢查，所有符合條件的奶牛（被感染的奶牛）都應(yīng)入選至試驗(yàn)中。

應(yīng)提交牛群/奶牛的一般性描述數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)包括整個(gè)成年牛群的大小、當(dāng)前泌乳的奶牛數(shù)、牛群中被取樣的泌乳奶牛數(shù)和百分率、感染乳腺炎的泌乳奶牛數(shù)和百分率、每頭奶牛的大致年齡、品種、當(dāng)前日產(chǎn)奶量、泌乳次數(shù)和泌乳階段。

在進(jìn)行亞臨床型傳染性乳腺炎研究時(shí)，建議試驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)/取樣調(diào)查。試驗(yàn)前的培養(yǎng)或取樣檢查應(yīng)包括來(lái)自整個(gè)牛群中所有泌乳奶牛的全部乳區(qū)的奶樣，牛群中所有感染乳區(qū)應(yīng)包括在研究中。

確定治療臨床型乳腺炎的復(fù)方產(chǎn)品療效則應(yīng)按目前對(duì)復(fù)方藥物的要求進(jìn)行研究，建議申報(bào)單位在研發(fā)這類產(chǎn)品前有必要對(duì)提交數(shù)據(jù)的要求以及特定復(fù)方產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行分析討論。

入選的受試動(dòng)物應(yīng)無(wú)相關(guān)抗乳腺炎疫苗的接種史。這些產(chǎn)品包括但并不局限于疫苗、菌苗、免疫調(diào)節(jié)劑、血清抗體或抗毒素等。

供臨床試驗(yàn)的牛群必須有足夠數(shù)量的臨床乳腺炎病例以滿足對(duì)各組的動(dòng)物數(shù)要求。在開始研究前應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明（規(guī)定）牛群數(shù)和在每個(gè)牛群的分組情況。

建議采用盲法研究，并提供所用盲法的詳細(xì)情況。

（二）臨床試驗(yàn)

1. 劑量篩選試驗(yàn)（Ⅱ期臨床試驗(yàn)）

包括一個(gè)對(duì)照組和至少3個(gè)藥物劑量組，其中3個(gè)藥物劑量組由一個(gè)不十分有效的較低劑量組、一個(gè)推薦劑量組和一個(gè)較高但并不比推薦劑量更有效的劑量組組成。劑量篩選試驗(yàn)應(yīng)至少在兩個(gè)奶牛場(chǎng)執(zhí)行。每個(gè)奶牛場(chǎng)每組動(dòng)物不少于15頭。

2. 劑量確認(rèn)試驗(yàn)（Ⅲ期臨床試驗(yàn)）

以劑量篩選試驗(yàn)中確定的有效劑量為基礎(chǔ)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)必須包含一個(gè)對(duì)照組，最好是陰性對(duì)照組。如果未使用陰性對(duì)照研究應(yīng)說(shuō)明理由。對(duì)于原創(chuàng)藥物，由于我國(guó)各地氣候和地域地理?xiàng)l件不同，劑量確認(rèn)試驗(yàn)應(yīng)至少在兩個(gè)地區(qū)（南方、北方各一個(gè)）進(jìn)行，并由不同的研究機(jī)構(gòu)實(shí)施。每個(gè)地區(qū)每組動(dòng)物不少于30頭。

3. 評(píng)價(jià)參數(shù)

評(píng)價(jià)藥物有效性的關(guān)鍵參數(shù)是用藥后的臨床反應(yīng)和細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果。研究人員應(yīng)參照奶牛乳腺炎診斷的微生物學(xué)程序進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)和鑒定。

（三）用于泌乳期奶牛臨床型乳腺炎的獸藥

1.動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)

（1）試驗(yàn)動(dòng)物以患有臨床型乳腺炎的泌乳期奶牛（如含有凝乳塊、絮狀物及水樣外觀的視覺(jué)異常乳和/或乳房出現(xiàn)如腫脹、潮紅和痛感的臨床癥狀）為單元。一般只有單個(gè)乳區(qū)患有臨床型乳腺炎的奶牛才能被登記用于試驗(yàn)。

（2）在登記入選奶牛時(shí)需對(duì)臨床型乳腺炎（如是否有凝乳塊、絮狀物、水樣外觀的異常奶，和/或乳房出現(xiàn)腫脹、發(fā)紅和疼痛的臨床癥狀）進(jìn)行診斷。臨床型乳房炎由研究者在采樣時(shí)做出診斷，但在其他時(shí)間可由奶牛場(chǎng)的獸醫(yī)進(jìn)行評(píng)估。

2. 治療前采樣（研究者在治療前應(yīng)對(duì)牛群進(jìn)行篩選，以使感染某一病原菌的牛在各治療組中均勻分配）

（1）在治療前采集一份乳樣進(jìn)行微生物學(xué)檢查和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。測(cè)定分離的乳腺炎病原菌最小抑菌濃度（MIC）和MIC臨界點(diǎn)，以評(píng)估病原菌對(duì)新的抗感染藥物的敏感性。

（2）采樣時(shí)應(yīng)對(duì)來(lái)自受試乳區(qū)的乳樣進(jìn)行臨床型乳腺炎癥狀（如凝乳塊、絮狀物、水樣外觀的異常奶）檢查。每次擠奶時(shí)將陽(yáng)性結(jié)果記錄在動(dòng)物的數(shù)據(jù)記錄表中，并與每次擠奶時(shí)的日常檢查收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總。

3. 治療

只有單個(gè)乳區(qū)感染的奶牛才被用于治療試驗(yàn)。在入選試驗(yàn)期間，若奶牛的其它非用藥乳區(qū)發(fā)生乳腺炎，則從試驗(yàn)中剔除該奶牛，但不認(rèn)為是治療失敗。在評(píng)估療效時(shí)應(yīng)剔除對(duì)其他炎癥乳區(qū)要求和/或接受治療的奶牛。對(duì)照選擇包括：試驗(yàn)前后對(duì)比、與已批準(zhǔn)的對(duì)照藥物治療對(duì)比。

4. 治療后采樣

在療效評(píng)估期間（治療后14～28天）各用藥的乳區(qū)至少要采集2次乳樣，并對(duì)每份乳樣分別進(jìn)行微生物學(xué)檢測(cè)和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。2份乳樣間的采樣間隔時(shí)間至少為7天。

5. 療效的評(píng)估

（1）根據(jù)給藥后7～14天之間對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)治愈情況。只有在治療前從乳樣中分離出乳腺炎病原菌的臨床型乳腺炎病例才能用于計(jì)算治愈率。體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)僅作為檢查各治療組內(nèi)“治愈”和“未治愈”奶牛的平均體細(xì)胞數(shù)之間的變化趨勢(shì)。

（2）治愈標(biāo)準(zhǔn)：臨床上治愈的乳區(qū)必須泌乳正常、無(wú)臨床型乳腺炎癥狀，且在微生物學(xué)分離培養(yǎng)上，治療前乳樣中分離出的乳腺炎病原菌在治療后采集的奶樣中不得再分離出。

（3）來(lái)自臨床研究的乳腺炎病原菌分布情況將用于確定標(biāo)簽的療效說(shuō)明。例如，對(duì)葡萄球菌和鏈球菌性乳腺炎病原菌有效的抗微生物藥適應(yīng)證是：“用于治療由葡萄球菌屬（如金黃色葡萄球菌）和鏈球菌屬（如無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）細(xì)菌引起的臨床型乳腺炎”。

（四）用于泌乳期奶牛亞臨床型乳腺炎的獸藥

所有防治泌乳期奶牛乳腺炎的抗微生物藥必須對(duì)臨床型乳腺炎有效，一般不會(huì)單獨(dú)批準(zhǔn)僅用于防治泌乳期奶牛亞臨床型乳房炎的產(chǎn)品。要獲得治療亞臨床型乳腺炎的適應(yīng)證，則需要另外提供亞臨床型乳腺炎的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1. 動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)

選擇陽(yáng)性乳區(qū)（感染）的奶牛用于亞臨床型乳腺炎治療試驗(yàn)。研究者在采樣前應(yīng)對(duì)牛群進(jìn)行篩選以盡可能使病原菌在各治療組中平均分配。

2. 治療前采樣

治療亞臨床型乳腺炎產(chǎn)品的研究將是一種隨機(jī)化研究。在治療前要求獲得2份微生物學(xué)和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)檢測(cè)樣本，采樣間隔時(shí)間至少24小時(shí)。

3. 治療

在亞臨床研究中，對(duì)任何奶牛只治療一個(gè)乳區(qū)。對(duì)存在多個(gè)乳區(qū)感染的奶牛，將隨機(jī)選擇其中的一個(gè)感染乳區(qū)進(jìn)行治療，其他乳區(qū)不用藥治療。如果其他乳區(qū)因臨床型乳腺炎而要求額外治療時(shí)，則應(yīng)從研究中剔除該奶牛。

4. 治療后采樣

在治療后14～28天內(nèi)，采集2次乳樣用于微生物學(xué)和體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)檢測(cè)。2份乳樣的采樣間隔時(shí)間至少為7天。

5. 治愈的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）在治療后7～14天期間根據(jù)陰性對(duì)照組研究結(jié)果評(píng)估治愈情況。在亞臨床治療研究中，體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)結(jié)果如臨床研究一樣只用于檢查體細(xì)胞數(shù)的變化情況。

（2）治療前從乳樣中分離出的乳腺炎病原菌在治療后采集的乳品中應(yīng)不得再檢出。

（3）依據(jù)亞臨床研究中獲得的有效數(shù)據(jù)，產(chǎn)品將得到類似下面的適應(yīng)證說(shuō)明：用于治療由葡萄球菌屬（如金黃色葡萄球菌）、鏈球菌屬（如無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）細(xì)菌引起的臨床和亞臨床型乳腺炎。

（五）用于干乳期奶牛亞臨床型乳腺炎的藥物

對(duì)擬用于干乳期的藥物，有必要分別進(jìn)行治療和預(yù)防效果研究。治療將意味著消除干乳期奶牛中已有的感染，而預(yù)防則意味著防止干乳期奶牛出現(xiàn)新的感染。

對(duì)預(yù)防性用藥，有必要通過(guò)陰性對(duì)照組確定新感染比率。

1. 動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)

將進(jìn)入泌乳后期準(zhǔn)備干奶的奶牛納入試驗(yàn)研究中。

2. 給藥前采樣

研究者在治療前1周應(yīng)從每個(gè)乳區(qū)采集2次乳樣用于微生物分離培養(yǎng)，2次乳樣的采樣間隔至少為24小時(shí)，其中第二份樣品在預(yù)期干奶的當(dāng)天采集。其中一份來(lái)自給藥前的奶牛每個(gè)乳區(qū)的奶樣用于測(cè)定體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。

3. 給藥

用于干乳期治療和預(yù)防的藥物，入選奶牛的所有乳區(qū)應(yīng)在第二次乳樣采集后通過(guò)乳房灌注給藥。

4. 給藥后采樣

用于干乳期治療和預(yù)防的藥物，應(yīng)在奶牛產(chǎn)犢后1～5天內(nèi)從每個(gè)乳區(qū)采集兩次樣品用于細(xì)菌分離培養(yǎng)，兩次采樣間隔應(yīng)為24小時(shí)。同時(shí)測(cè)定每個(gè)乳區(qū)第2份奶樣的體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。

5. 療效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）對(duì)于治療藥物：在再次泌乳時(shí)微生物培養(yǎng)應(yīng)為陰性且無(wú)臨床癥狀。

（2）對(duì)于預(yù)防藥物：陽(yáng)性對(duì)照組的，受試藥的預(yù)防效果應(yīng)不顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組的療效；設(shè)陰性對(duì)照組的，則受試藥組的新增感染率至少降低50%。

（3）體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)的結(jié)果只用于臨床研究中檢查體細(xì)胞數(shù)的變化情況。

四、療效的判定標(biāo)準(zhǔn)

以下各表所示的給藥前和給藥后細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)結(jié)果是本文中所述的采集一份或2份乳樣的檢測(cè)結(jié)果。這些組合可外推至其他病原菌。

（一）用于泌乳期奶牛的產(chǎn)品

表1 臨床型乳腺炎治療結(jié)果

注釋：

1. 對(duì)于傳染性乳腺炎病原菌（金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌），只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果，動(dòng)物即可入選試驗(yàn)中，對(duì)于其他病原菌，給藥前的2份樣品連續(xù)培養(yǎng)均必須為陽(yáng)性的動(dòng)物才可入選試驗(yàn)研究。

2. 對(duì)于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果（與治療前樣品中分離培養(yǎng)出的細(xì)菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無(wú)乳鏈球菌。

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應(yīng)予以記錄；這種事件的發(fā)生率在最終的試驗(yàn)報(bào)告表中應(yīng)給予表述。

注：應(yīng)在原始數(shù)據(jù)表中記錄給藥前和給藥后乳汁異常跡象和乳腺炎的臨床癥狀。

表2 亞臨床型乳腺炎治療結(jié)果

注釋：

1. 對(duì)于傳染性乳腺炎病原菌（金葡菌和無(wú)乳鏈球菌），只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果動(dòng)物即可入選試驗(yàn)中，對(duì)于其他病原菌，給藥前的兩份樣品連續(xù)培養(yǎng)均必須為陽(yáng)性的動(dòng)物才可入選試驗(yàn)研究。

2. 對(duì)于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果（與治療前樣品中分離培養(yǎng)出的細(xì)菌相同）即為治療失??；

3. 金黃色葡萄球菌；

4. 無(wú)乳鏈球菌；

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應(yīng)予以記錄；這種事件的發(fā)生率在最終的試驗(yàn)報(bào)告表中應(yīng)給予表述。

（二）用于干乳期乳腺炎的藥物

表3  治療干乳期亞臨床型乳腺炎結(jié)果

注釋：

1. 對(duì)于傳染性乳腺炎病原菌（金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌），只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果，動(dòng)物即可入選試驗(yàn)中，對(duì)于其他病原菌，給藥前的2份樣品連續(xù)培養(yǎng)均必須為陽(yáng)性的動(dòng)物才可入選試驗(yàn)研究。

2. 對(duì)于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果（與治療前樣品中分離培養(yǎng)出的細(xì)菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無(wú)乳鏈球菌。

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應(yīng)予以記錄；這種事件的發(fā)生率在最終的試驗(yàn)報(bào)告表中應(yīng)給予表述。

表4  預(yù)防干乳期亞臨床型乳腺炎結(jié)果

注釋：

1. 對(duì)于預(yù)防適應(yīng)證，所有給藥前的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)為陰性。

2. 對(duì)于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果（與治療前樣品中分離培養(yǎng)出的細(xì)菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無(wú)乳鏈球菌。

注：

1. 傳染性的亞臨床型乳腺炎的預(yù)防效果應(yīng)能使新感染至少應(yīng)下降50%；

2. 應(yīng)測(cè)定一份來(lái)自給藥前乳樣的體細(xì)胞定量計(jì)數(shù)。

 來(lái)源：獸藥評(píng)審中心

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