獸藥急性毒性試驗(yàn)（LD₅₀測(cè)定）指導(dǎo)原則

一、概述

（一）定義與目的

急性毒性試驗(yàn)是指一日內(nèi)對(duì)動(dòng)物單次或多次給藥，連續(xù)觀察給藥后動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況的試驗(yàn)方法。經(jīng)口（注射）一次性或24h內(nèi)多次給予受試物后，在短時(shí)間內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，引起半數(shù)致死的劑量稱(chēng)為半數(shù)致死劑量，通常用LD50表示。這是評(píng)價(jià)獸藥急性毒性的常用方法。

為了確保急性毒性試驗(yàn)（LD50測(cè)定）結(jié)果的真實(shí)性、可靠性和可追溯性，根據(jù)新獸藥研究的規(guī)律，結(jié)合國(guó)內(nèi)獸藥毒理學(xué)評(píng)價(jià)的實(shí)際情況制定了本指導(dǎo)原則。

（二）適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于獸用化學(xué)藥品、中獸藥、消毒劑及飼料藥物添加劑的急性毒性作用測(cè)定。

二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（一）材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用兩種性別的初成年小鼠和/或大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠體重為18～22g，大鼠體重為180～220g。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)3～5天。

2.受試藥物及配制

（1）申報(bào)獸藥的原料或制劑  應(yīng)為與其他試驗(yàn)同一批號(hào)的產(chǎn)品。

（2）受試物溶液配制  一般采用水或食用植物油（如玉米油、花生油、橄欖油等）配制受試物溶液?？煽紤]用吐溫-80作為助溶劑，或用羧甲基纖維素鈉、明膠、淀粉等配制成混懸液，不能作成混懸液時(shí)，可制備成其它型式（如糊狀物等）。必要時(shí)可選用二甲基亞砜溶解受試物，但不能采用具有明顯毒性的有機(jī)溶劑。如采用未知毒性的溶劑應(yīng)設(shè)對(duì)照組觀察。

3.受試藥物給藥方法

    按受試藥物檢測(cè)要求經(jīng)口或注射給藥。一般一次性給予受試藥物。如估計(jì)受試物的毒性很低或溶解度很低，可一日內(nèi)多次給予，每次間隔2～3h，仍合并為一次劑量計(jì)算。若總劑量達(dá)到5000mg/kg仍不引起動(dòng)物死亡時(shí)，即停止更多次的給予。

     給予受試物體積要求小鼠為0.1～0.2mL/10g體重，大鼠為0.5～1.0 mL/100 g體重。經(jīng)口給予受試物，動(dòng)物應(yīng)隔夜空腹進(jìn)行（一般禁食8～12h左右，不限制飲水）。

（二）試驗(yàn)步驟

1.預(yù)試驗(yàn)

每組設(shè)4只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（雌、雄各半），擬定高劑量組劑量，再按3～5的倍數(shù)遞減設(shè)定若干劑量組，依次進(jìn)行試驗(yàn)，找出4/4致死劑量和0/4致死劑量。

如果高劑量組已達(dá)5000mg/kg的劑量，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率為0/4，并且將動(dòng)物數(shù)增至10只（雌、雄各半），并重復(fù)兩次試驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡，則可結(jié)束整個(gè)急性毒性試驗(yàn)，急性毒性試驗(yàn)（LD₅₀測(cè)定）結(jié)論為：受試物LD₅₀大于5000mg/kg。

2.正式試驗(yàn)

一般設(shè)5～7個(gè)劑量組。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)獲得的4/4致死劑量（b）和0/4致死劑量（a）的比值來(lái)確定正式試驗(yàn)組數(shù)（N）；比值為2～3時(shí)，設(shè)4～5組；比值為3～10時(shí)，設(shè)5～7組；比值大于10時(shí)，設(shè)7組。

按下列公式求得相鄰兩組劑量比值（r）：

                    r = log^-1

    以預(yù)試驗(yàn)獲得的4/4致死劑量（b）作為正式試驗(yàn)高劑量組（第一組）的劑量，按r值等比求得其它各劑量組的劑量。

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱(chēng)重、標(biāo)記編號(hào)和分組

雄、雌動(dòng)物分開(kāi)進(jìn)行正式試驗(yàn)，每組不小于10只動(dòng)物。分別對(duì)雄、雌動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記及稱(chēng)重，按設(shè)計(jì)試驗(yàn)組數(shù)（N）對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組。分組采用完全隨機(jī)法。

（2）受試藥物溶液配制

按“1：K系列稀釋法”等容量配制各劑量組所需的受試藥物溶液，根據(jù)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)劑量，按試驗(yàn)動(dòng)物給予受試藥物的體積要求，首先確定最大劑量組（如第一組）所需配制的受試藥物溶液濃度C₁以及各劑量組所需受試藥物溶液的體積v。

受試藥物母液應(yīng)配制的濃度C=C₁，應(yīng)配制的體積V（mL）按下列公式計(jì)算：

V=（其中K=）

根據(jù)母液濃度及體積計(jì)算需稱(chēng)取的受試藥物量（mg或mL）。

稱(chēng)取受試藥物，置燒杯內(nèi)，加入選定的溶劑溶解或稀釋?zhuān)D(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)，充分混勻并定容，即獲得濃度C=C₁的受試物母液。從中取出供最大劑量組（如第一組）給藥用的溶液體積v，向原溶液中加入同體積的溶劑，混勻后溶液濃度為C₁×K，正好是第二組所要求的劑量濃度C₂；從中取出供第二組給藥用的溶液體積v，再加入同體積的溶劑，混勻后溶液濃度為C₂×K，正好是第三組所要求的劑量濃度C₃。依此類(lèi)推，配制得到各劑量組所需濃度及體積的受試藥物溶液。

（3）給藥方法

按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)口（注射）給予受試藥物的體積要求，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予的受試藥物體積。

按要求保定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃或注射給藥。如在給藥過(guò)程中因擠壓、嗆肺等造成死亡，需及時(shí)補(bǔ)足每組的動(dòng)物數(shù)量。

（4）試驗(yàn)觀察

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥后一般觀察7天，若給藥4天后繼續(xù)有死亡的，則需觀察14天，必要時(shí)可延長(zhǎng)觀察至28天。認(rèn)真觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程(觀察項(xiàng)目見(jiàn)6.1)，獲取中毒特點(diǎn)及毒作用特征，對(duì)死亡動(dòng)物需進(jìn)行解剖，觀察其中毒病理變化，并作好記錄。

（三）數(shù)據(jù)整理

當(dāng)雄性和雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)受試藥物反應(yīng)差異顯著時(shí)，應(yīng)分別對(duì)其試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算各自的半數(shù)致死量（LD₅₀）；性別差異不顯著，則將雄性和雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)集中整理，統(tǒng)一計(jì)算分析。

根據(jù)試驗(yàn)記錄，整理獲得下表中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

半數(shù)致死量（LD₅₀）計(jì)算方法：

將試驗(yàn)獲得的各項(xiàng)數(shù)值代入下列公式

LD₅₀=lg^-1                            

S_x50=                                                  

LD₅₀的95%可信限= lg^-1（lgLD₅₀±1.96×S_x50）                       

式中：

  Xm —— 最大劑量的對(duì)數(shù)值；

        i —— 組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差；

        p —— 各劑量組死亡率（以小數(shù)表示）；

        q —— 各劑量組存活率，q =1-p；

—— 各劑量組死亡率之和；

n  —— 各組動(dòng)物數(shù)；

S_x50 —— lgLD₅₀的標(biāo)準(zhǔn)誤差

（四）結(jié)果評(píng)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥后中毒癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、癥狀表現(xiàn)、死亡出現(xiàn)時(shí)間、尸體解剖病理變化及半數(shù)致死量（LD₅₀），參照表3-2化學(xué)物急性毒性（LD₅₀）劑量分級(jí)表，對(duì)受試藥物進(jìn)行評(píng)定。評(píng)定內(nèi)容包括：

受試物主要中毒癥狀表現(xiàn)；

受試物半數(shù)致死量(LD₅₀)及其95%可信限（單位mg/kg）；

受試物毒性分級(jí)；

（五）注意事項(xiàng)

1.本指導(dǎo)原則僅對(duì)寇氏（korbor）法的技術(shù)環(huán)節(jié)及要求進(jìn)行了規(guī)定，采用其它方法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)需參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.3-2003的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

2.除特別注明外，試驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純?cè)噭?，?dòng)物為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境要求達(dá)到SPF級(jí)。

三、試驗(yàn)報(bào)告

為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的毒性，對(duì)試驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容做如下要求：

1.試驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

2.試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)。

3.試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、參加者及電子郵箱。

4.受試藥物需注明獸藥名稱(chēng)、生產(chǎn)廠(chǎng)家、規(guī)格、生產(chǎn)批號(hào)及用法與用量。

5.試驗(yàn)動(dòng)物的品種與品系、體重、日齡或月齡、健康狀況、檢疫情況等。

6.歸納總結(jié)該藥物的試驗(yàn)結(jié)果，確定受試藥物的LD50和并對(duì)其急性毒性進(jìn)行評(píng)定等。

7.參考文獻(xiàn)。

8.試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)有詳細(xì)的試驗(yàn)原始記錄。原始資料保存處、聯(lián)系人、電話(huà)。

9.試驗(yàn)單位（加蓋公章）。

四、附錄及說(shuō)明

附表4-1  嚙齒動(dòng)物中毒表現(xiàn)觀察項(xiàng)目

附表4-2  化學(xué)物急性毒性（LD₅₀）劑量分級(jí)表

來(lái)源:獸藥評(píng)審中心

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