獸藥急性毒性試驗（LD₅₀測定）指導(dǎo)原則

一、概述

（一）定義與目的

急性毒性試驗是指一日內(nèi)對動物單次或多次給藥，連續(xù)觀察給藥后動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況的試驗方法。經(jīng)口（注射）一次性或24h內(nèi)多次給予受試物后，在短時間內(nèi)觀察實驗動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，引起半數(shù)致死的劑量稱為半數(shù)致死劑量，通常用LD50表示。這是評價獸藥急性毒性的常用方法。

為了確保急性毒性試驗（LD50測定）結(jié)果的真實性、可靠性和可追溯性，根據(jù)新獸藥研究的規(guī)律，結(jié)合國內(nèi)獸藥毒理學(xué)評價的實際情況制定了本指導(dǎo)原則。

（二）適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于獸用化學(xué)藥品、中獸藥、消毒劑及飼料藥物添加劑的急性毒性作用測定。

二、試驗設(shè)計

（一）材料與方法

1.實驗動物

采用兩種性別的初成年小鼠和/或大鼠進(jìn)行試驗。小鼠體重為18～22g，大鼠體重為180～220g。動物購買后環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)3～5天。

2.受試藥物及配制

（1）申報獸藥的原料或制劑  應(yīng)為與其他試驗同一批號的產(chǎn)品。

（2）受試物溶液配制  一般采用水或食用植物油（如玉米油、花生油、橄欖油等）配制受試物溶液?？煽紤]用吐溫-80作為助溶劑，或用羧甲基纖維素鈉、明膠、淀粉等配制成混懸液，不能作成混懸液時，可制備成其它型式（如糊狀物等）。必要時可選用二甲基亞砜溶解受試物，但不能采用具有明顯毒性的有機(jī)溶劑。如采用未知毒性的溶劑應(yīng)設(shè)對照組觀察。

3.受試藥物給藥方法

    按受試藥物檢測要求經(jīng)口或注射給藥。一般一次性給予受試藥物。如估計受試物的毒性很低或溶解度很低，可一日內(nèi)多次給予，每次間隔2～3h，仍合并為一次劑量計算。若總劑量達(dá)到5000mg/kg仍不引起動物死亡時，即停止更多次的給予。

     給予受試物體積要求小鼠為0.1～0.2mL/10g體重，大鼠為0.5～1.0 mL/100 g體重。經(jīng)口給予受試物，動物應(yīng)隔夜空腹進(jìn)行（一般禁食8～12h左右，不限制飲水）。

（二）試驗步驟

1.預(yù)試驗

每組設(shè)4只實驗動物（雌、雄各半），擬定高劑量組劑量，再按3～5的倍數(shù)遞減設(shè)定若干劑量組，依次進(jìn)行試驗，找出4/4致死劑量和0/4致死劑量。

如果高劑量組已達(dá)5000mg/kg的劑量，實驗動物死亡率為0/4，并且將動物數(shù)增至10只（雌、雄各半），并重復(fù)兩次試驗動物均未出現(xiàn)死亡，則可結(jié)束整個急性毒性試驗，急性毒性試驗（LD₅₀測定）結(jié)論為：受試物LD₅₀大于5000mg/kg。

2.正式試驗

一般設(shè)5～7個劑量組。根據(jù)預(yù)備試驗獲得的4/4致死劑量（b）和0/4致死劑量（a）的比值來確定正式試驗組數(shù)（N）；比值為2～3時，設(shè)4～5組；比值為3～10時，設(shè)5～7組；比值大于10時，設(shè)7組。

按下列公式求得相鄰兩組劑量比值（r）：

                    r = log^-1

    以預(yù)試驗獲得的4/4致死劑量（b）作為正式試驗高劑量組（第一組）的劑量，按r值等比求得其它各劑量組的劑量。

（1）實驗動物稱重、標(biāo)記編號和分組

雄、雌動物分開進(jìn)行正式試驗，每組不小于10只動物。分別對雄、雌動物進(jìn)行編號標(biāo)記及稱重，按設(shè)計試驗組數(shù)（N）對實驗動物進(jìn)行分組。分組采用完全隨機(jī)法。

（2）受試藥物溶液配制

按“1：K系列稀釋法”等容量配制各劑量組所需的受試藥物溶液，根據(jù)設(shè)計的試驗劑量，按試驗動物給予受試藥物的體積要求，首先確定最大劑量組（如第一組）所需配制的受試藥物溶液濃度C₁以及各劑量組所需受試藥物溶液的體積v。

受試藥物母液應(yīng)配制的濃度C=C₁，應(yīng)配制的體積V（mL）按下列公式計算：

V=（其中K=）

根據(jù)母液濃度及體積計算需稱取的受試藥物量（mg或mL）。

稱取受試藥物，置燒杯內(nèi)，加入選定的溶劑溶解或稀釋，轉(zhuǎn)入容量瓶內(nèi)，充分混勻并定容，即獲得濃度C=C₁的受試物母液。從中取出供最大劑量組（如第一組）給藥用的溶液體積v，向原溶液中加入同體積的溶劑，混勻后溶液濃度為C₁×K，正好是第二組所要求的劑量濃度C₂；從中取出供第二組給藥用的溶液體積v，再加入同體積的溶劑，混勻后溶液濃度為C₂×K，正好是第三組所要求的劑量濃度C₃。依此類推，配制得到各劑量組所需濃度及體積的受試藥物溶液。

（3）給藥方法

按實驗動物經(jīng)口（注射）給予受試藥物的體積要求，根據(jù)各實驗動物的體重，計算各實驗動物給予的受試藥物體積。

按要求保定實驗動物進(jìn)行灌胃或注射給藥。如在給藥過程中因擠壓、嗆肺等造成死亡，需及時補足每組的動物數(shù)量。

（4）試驗觀察

實驗動物給藥后一般觀察7天，若給藥4天后繼續(xù)有死亡的，則需觀察14天，必要時可延長觀察至28天。認(rèn)真觀察實驗動物中毒的發(fā)生、發(fā)展過程(觀察項目見6.1)，獲取中毒特點及毒作用特征，對死亡動物需進(jìn)行解剖，觀察其中毒病理變化，并作好記錄。

（三）數(shù)據(jù)整理

當(dāng)雄性和雌性實驗動物對受試藥物反應(yīng)差異顯著時，應(yīng)分別對其試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計算各自的半數(shù)致死量（LD₅₀）；性別差異不顯著，則將雄性和雌性實驗動物的試驗數(shù)據(jù)集中整理，統(tǒng)一計算分析。

根據(jù)試驗記錄，整理獲得下表中的各項數(shù)據(jù)。

半數(shù)致死量（LD₅₀）計算方法：

將試驗獲得的各項數(shù)值代入下列公式

LD₅₀=lg^-1                            

S_x50=                                                  

LD₅₀的95%可信限= lg^-1（lgLD₅₀±1.96×S_x50）                       

式中：

  Xm —— 最大劑量的對數(shù)值；

        i —— 組距，即相鄰兩組劑量對數(shù)值之差；

        p —— 各劑量組死亡率（以小數(shù)表示）；

        q —— 各劑量組存活率，q =1-p；

—— 各劑量組死亡率之和；

n  —— 各組動物數(shù)；

S_x50 —— lgLD₅₀的標(biāo)準(zhǔn)誤差

（四）結(jié)果評定

根據(jù)實驗動物給藥后中毒癥狀出現(xiàn)的時間、癥狀表現(xiàn)、死亡出現(xiàn)時間、尸體解剖病理變化及半數(shù)致死量（LD₅₀），參照表3-2化學(xué)物急性毒性（LD₅₀）劑量分級表，對受試藥物進(jìn)行評定。評定內(nèi)容包括：

受試物主要中毒癥狀表現(xiàn)；

受試物半數(shù)致死量(LD₅₀)及其95%可信限（單位mg/kg）；

受試物毒性分級；

（五）注意事項

1.本指導(dǎo)原則僅對寇氏（korbor）法的技術(shù)環(huán)節(jié)及要求進(jìn)行了規(guī)定，采用其它方法進(jìn)行急性毒性試驗需參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.3-2003的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

2.除特別注明外，試驗用水為蒸餾水，試劑為分析純試劑，動物為SPF級實驗動物。

3.實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境要求達(dá)到SPF級。

三、試驗報告

為公正、科學(xué)地評價藥物的毒性，對試驗報告內(nèi)容做如下要求：

1.試驗?zāi)康摹?/span>

2.試驗時間與地點。

3.試驗設(shè)計者、負(fù)責(zé)人、參加者及電子郵箱。

4.受試藥物需注明獸藥名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、生產(chǎn)批號及用法與用量。

5.試驗動物的品種與品系、體重、日齡或月齡、健康狀況、檢疫情況等。

6.歸納總結(jié)該藥物的試驗結(jié)果，確定受試藥物的LD50和并對其急性毒性進(jìn)行評定等。

7.參考文獻(xiàn)。

8.試驗數(shù)據(jù)，應(yīng)有詳細(xì)的試驗原始記錄。原始資料保存處、聯(lián)系人、電話。

9.試驗單位（加蓋公章）。

四、附錄及說明

附表4-1  嚙齒動物中毒表現(xiàn)觀察項目

附表4-2  化學(xué)物急性毒性（LD₅₀）劑量分級表

來源:獸藥評審中心

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